Metodos de transformación genética en Plantas

Biotecnología

¿Que es la Transformación Genética de Plantas?

Consiste en modificar genéticamente a la Planta para que empiece a producir algún compuesto ya sea de forma diferente o en mayores cantidades principalmente. Esta nueva Planta recibe el nombre de Planta Transgénica, el término “Transgénico” hace referencia a la introducción de un gen extraño a un organismo (del prefijo “trans” que significa atravesar distancias). En el contexto Biotecnológico, un  trans-génico es cuando se transfiere un fragmento de ADN de una célula a otra. Esencialmente esta planta modificada genéticamente sigue siendo la misma, pero más sin embargo alguno de sus genes han sido modificados o reemplazados por otros (de otras plantas o de bacterias). Aunque también se considera como Planta Transgénica aquella a la cual alguno de sus genes fue removido del genoma de la planta, igual con la finalidad de disminuir su toxicidad.

Una de las principales finalidades de hacer esto, es para aumentar la productividad agrícola, pues eventualmente lo que uno obtiene es toda una cosecha de plantas transgénicas, que puede transmitir esas características a sus descendientes, en la mayoría de los casos, pues en algunos casos estas características genéticas se pierde en las subsecuentes generaciones.

También se puede modificar genéticamente a una Planta usando métodos convencionales, como selección embrionaria o de características fenotípicas sin necesidad de técnicas de ingeniería genética.

Este auge de la producción de Plantas Transgénicas surgió durante las década de los 80s, y a partir del estudio de un parasito natural de plantas que puede modificar parte del genoma de la planta mediante la inserción de su propio genoma dentro de las células de la plantas. Este parasito ha tenido este tipo de relación simbiótica-genética con ciertas plantas por millones de años y funcionando de forma muy eficiente, por lo que se les ocurrió a los científicos utilizar el mecanismo genético de este microorganismo como la herramienta principal para transformar plantas genéticamente. Dicho organismo resulto ser una Bacteria llamada “Agrobacterium tumefaciens“, que es una Proteobacteria Alpha de la familia Rhizobiaceae, que incluye a las fijadoras de nitrógeno que viven en simbiosis con las legumbres. A diferencia de éstas, la Agrobacterium es un parásito y puede causar daño a la planta afectada. Su terminología de Tumefaciens es debido a que produce tumores en los tallos o troncos de las plantas (Fig. 1) y este desarrollo de tumores se debe a que Agrobacterium tiene la capacidad de transferir parte de su propio material genético al de la planta hospedera.

Pero cómo se modifica entonces a una planta por ingeniería genética?

Primeramente hay que hacer cultivo celulares de muestras de la Planta en donde se llevara a cabo la modificación genética, y a partir de estas células se regeneran entonces las plantas completas ya modificadas, las cuales llevan los genes transferidos, que cuando crecen los expresarán y eventualmente los podrán transmitir a su descendencia.

 

Bueno, para lograr esto hay actualmente diferentes Métodos o Técnicas para transformar genéticamente a la planta. Normalmente se clasifican en Métodos Directos y Métodos Indirectos, esto debido a la forma o técnica (sistema de transferencia de genes) como la planta será modificada.

 

 

 

METODOS DIRECTOS:

Estos son Sistemas de transferencia de genes que emplea procedimientos de naturaleza química, físicos/mecánicos, fisicoquímica y eléctricos. Estas técnicas son denominadas como Técnicas de Transferencia Génica Directa (DGT). El desarrollo de estos métodos, se basó en las técnicas físicas usadas en la transformación de células animales en cultivo, las cuales ya llevaban varios años de desarrollo, pues es más fácil y estable manipular genéticamente a animales que a plantas. Estos métodos se usan principalmente para plantas Monocotiledóneas (cereales como arroz, maíz y trigo) ya que no son fácilmente transformadas por los métodos convencionales usados con la bacteria Agrobacterium tumefaciens.

 

 

1) Liposomas

Los Liposomas (Fig.2) son vesículas lipídicas formadas por varias bicapas de lípidos que encapsulan agua o gas, poseen diámetros del orden de nanómetros, con diferentes formas y tamaños. Pueden estar formados por fosfolípidos, fosfatidiletanolamina, ácidos grasos o cationes bivalentes. Los Liposomas presentan característica muy similares a las membranas biológicas, con una tendencia natural a ligarse a células y tejidos interactuando con estos por absorción, fusión o intercambio lipídico.  Este es uno de los métodos más difíciles y su utilización ha sido muy limitada ya que en este método, el cassette/cartucho de expresión es encapsulado en una esfera lipídica(Liposoma) que permite su paso a través de la célula vegetal por endocitosis, ya sea por el plasmodesma o directamente por la pared celular, hasta que llega a el núcleo  celular.

Aunque esta técnica es muy difícil y poco usada, posee muy buenas ventajas como son:

  1. a) La protección contra la degradación por nucleasas.
  2. b) La capacidad de portar grandes fragmentos de DNA.
  3. c) Una biocompatibilidad con membranas.
  4. d) Y no requiere de un portador para el DNA.

Pese a dichas dificultades, la fusión de Liposomas que contienen ADN con protoplastos está bien establecida en la producción de plantas transgénicas.

Entre los principales problemas que se han reportado con este sistema de transformación, podemos mencionas los siguientes:

  1. a) Frecuencia de transformación muy baja.
  2. b) Inserción del DNA en tándem.
  3. c) La preparación de los Liposomas.
  4. d) La encapsulación del material genético a transferir.

Pero estos problemas se han solucionado parcialmente con la implementación de nuevas técnicas y la utilización de nuevos compuestos, para la preparación de Liposomas.

2) Biobalística

También llamada bombardeo con microproyectiles, es el método alternativo más importante para transferir DNA a plantas. Se basa en utilizar microproyectiles recubiertos del DNA que se desea transferir, son disparados sobre los tejidos vegetales a altas velocidades que atraviesan la pared y la membrana celular, llevando al interior de la célula los genes de interés para que se integren en el genoma vegetal. La técnica consiste en bañar partículas esféricas de oro o tungsteno (0,4-1,2 micrómetros de diámetro) con DNA, el cual ha sido precipitado con CaCl2, espermidina o polietilen glicol. Después las partículas bañadas con DNA son aceleradas a altas velocidades (300-600 mt/sg) con un equipo especial llamado Pistola de Partículas ó Pistola de Genes (Fig.3). El DNA una vez dentro de la célula se separa de las partículas y se integra dentro del núcleo de las plantas.

Hay algunas desventajas que se presentan, como:

  1. a) Un porcentaje de éxito variable.
  2. b) Silenciamiento génico.
  3. c) Una introducción inestable del transgen.
  4. d) Presencia de rearreglos en el DNA transferido.
  5. e) Presencia de daños en los tejidos.
  6. f) El sistema llega a ser muy costoso.

3) Electroporación

Es la aplicación de pulsos eléctricos de alto voltaje en la membrana celular causando de forma temporal poros que permiten la entrada de macromoléculas al interior de la célula (Fig. 4). Lo que pasa es que las Membranas se desestabilizan causando pérdida temporal de la permeabilidad y produciendo poros reversibles, por lo que pasan macromoléculas, fuga de iones, escape de metabolitos y como consecuencia se presenta una mayor absorción de DNA que es lo que realmente nos interesa, y tras el tratamiento la membrana vuelve a su estado normal, como si nada hubiera pasado. Se lleva a cabo en un aparato llamado “Electroporador” que utiliza descargas de capacitores para producir pulsos de alto voltaje, originando una corriente eléctrica que se hace pasar a través de la suspensión que contiene las células.

Una de sus ventajas es que es casi diez veces más efectiva que la transformación mediada por métodos químicos, es muy eficiente y fácil de operar, relativamente simple y económico.  Una de sus desventajas es la necesidad de tener que usar Protoplastos (células sin pared), para que se pueda llevar a cabo la permeabilización de la membrana celular.

4) Sonicación

También llamada tratamiento con ultrasonidos o Sonoporación, es parecida a la Electroporación, pero acá se emplea ultrasonido con frecuencias superiores a 20 KHz, para generar permeabilidad en las membranas (mediante la inducción de poros transitorios) a través de los cuales el DNA foráneo ingresa a la célula. El aparato usado para los pulsos ultrasónicos se llama Sonicador (Fig. 5), que genera primeramente la formación de burbujas (poros transitorios) con la consecuente generación de elevada presión y temperatura. Y en segundo lugar las ondas ultrasónicas provocan la generación de corrientes alrededor de las burbujas que las hace crecer con rapidez haciéndolas colapsar. Durante este colapso, las burbujas producen ondas de choque muy fuertes, así como pequeños chorros de líquido a altas velocidades, produciendo daños en la superficie de objetos sólidos cercanos.

Entre sus ventajas está el hecho de ser bastante simple y rápida, así como su bajo costo. Es un método de transferencia génica muy versátil que permite introducir DNA exógeno desde protoplastos a células en suspensión y tejidos. El único problema o desventaja, es que las ondas ultrasónicas pueden causar daño a células a causa de la elevada temperatura que produce, lo que limitan el uso de esta técnica.

5) Protoplastos

Este fue el primer método de transferencia génica que se demostró que funcionaba en plantas. La técnica se basa en el principio de que la pared celular es la principal barrera para la captación de DNA, así que esta puede ser temporalmente extraída por enzimas de restricción y posteriormente se usan otros métodos para la transferencia génica (Fig. 6).

La desventaja de esta técnica es que no es muy eficiente para la generación de plantas a partir de cultivos de protoplastos. Pero como ventaja principal tenemos que en ensayos de expresión transitoria permiten la transformación de un número muy elevado de células individuales, facilitando ensayos cuantitativos con buenos niveles de replicación.

 

6) Microinyección

Es una de las técnicas más precisas para introducir DNA foráneo dentro de compartimentos específicos de las células, por medio del uso de micro agujas de vidrio para depositar el DNA foráneo en el interior de células vegetales (Fig. 7). El aparato usado para esta técnica se llama Micromanipulador.

 

Esta técnica ofrece la ventaja de que es uno de los dos métodos (junto con la transformación mediada por láser) que permite la transferencia génica a una célula concreta. La célula continuará su desarrollo y el transgén expresado lo hará también en su descendencia. Pero el principal problema en plantas es la pared celular, que hace a la técnica más dificultosa que en animales, ya que esta hace necesario el uso de capilares mucho más gruesos para llevar a cabo la microinyección, también dificulta mucho la visualización del núcleo provocando que la microinyección suceda muchas veces en el citoplasma. Otro problema es la presencia de grandes vacuolas en células vegetales, ya que si el DNA es transportado a su interior, este será degradado antes de alcanzar el núcleo.

Pero entre sus ventajas tenemos:

  1. a) Se puede optimizar la cantidad de DNA descargado.
  2. b) Se puede escoger la célula a transformar.
  3. c) La descarga del DNA foráneo es precisa y predecible.
  4. d) El proceso se realiza bajo control visual.
  5. e) Y se emplean cantidades micro.

 

 

 

 

7) Transformación mediada por láser

Se lleva a cabo mediante la utilización de un microláser enfocado en el sistema de iluminación del microscopio, permitiendo abrir orificios o poros transitorios en la pared celular y membrana plasmática de células vegetales, facilitando así la entrada del DNA foráneo hacia el interior de la célula.  Esta técnica resulta muy útil para manipular componentes celulares y orgánulos, porque el rayo puede ser dirigido directamente a esa área seleccionada, haciendo de esta técnica una valiosa herramienta.

 

Su principal ventaja es la alta precisión del método, ya que el Láser es dirigido con un microscopio se pueden ver y elegir exactamente las células que van a ser tratadas. Y puede ser llevada a cabo en un gran número de células, aunque la subsiguiente trasferencia de ADN esté mucho menos controlada.  Su limitación principal es el alto costo del equipo necesario para llevarla a cabo y la gran habilidad necesaria para manejar el láser.

 

 

METODOS INDIRECTOS:

Son métodos basados en la utilizar de vectores biológicos (como plásmidos) empleando sus característica naturales de patogenicidad para con las Plantas, para la introducción de transgenes al genoma vegetal. Entre los Vectores más utilizados y estables están el uso de las bacterias Agrobacterium tumefaciens y Agrobacterium rhizogenes, el de los virus (de DNA o RNA) y el de los Transposones.

 

 

1) Transformación con el Plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens

Este se usa debido a su alta capacidad y eficiencia de infectar diversas plantas, esta transformación mediada por Agrobacterium fue el primer sistema de transferencia de genes en producir plantas modificadas genéticamente en 1983. Esta bacteria es Gram negativa, induce formación de tumores (agalla de la corona, Fig. 8) en la unión del tallo con la raíz, principalmente en dicotiledóneas pero también en muy pocas Monocotiledóneas y algunas gimnospermas. Esta bacteria infecta dicotiledóneas como parte natural de su ciclo vital insertando genes foráneos (Plásmido Ti, Fig. 9) en ellas consiguiendo así que se expresen en forma de proteínas.

La infección por Agrobacterium en una planta es el resultado de un proceso de evolución altamente especializado que ha tomado millones de años en su perfeccionamiento, es por eso que su grado de eficiencia es muy alto y tiene un bajo índice de error.

Algunas de las desventajas de este son:

  1. a) El tejido a infectar debe presentar daño físico.
  2. b) Los vectores están diseñado solo para infectar el núcleo.
  3. c) Se requiere la eliminación de la bacteria de tejidos infectados usando antibióticos.
  4. d) El rango de hospederos está limitado a que estos sean susceptibles a la infección.

 

 

 

2) Transformación con el Plásmido Ri de Agrobacterium rhizogenes

Esta bacteria pertenece también a la familia de plásmidos de Agrobacterium, funciona de forma diferente provocando una proliferación de las raíces denominada “Raíz en Cabellera” en la plantas infectadas por A. rhizogenes y se llaman plásmidos Ri (de Root Inducing, Fig.10).  Estas raíces infectadas, como el tejido de la agalla, crecen rápidamente en un cultivo libre de bacterias. Al igual que los plásmidos Ti, los Plásmidos Ri dan origen a células vegetales transformadas que pueden regenerar plantas fértiles intactas y sanas (Fig.11).

Los procedimientos para usar este plásmido son similares a los de A. tumefaciens por lo que sus ventajas y desventajas son relativamente similares, en general esta técnica es muy eficiente.

3) Vectores virales

Esta técnica implica usar Virus que solo afectan a Plantas, se llaman Fitovirus y depende si su genoma es basado en DNA o RNA. Son usados principalmente para producir proteínas de interés debido a la expresión transitoria de genes foráneos, mediante la replicación de los virus en las plantas. La técnica consiste en modificar a los Virus para que sean capaces de transportar el transgen de interés al interior de la célula vegetal.

Existen dos grupos de virus vegetales, los virus DNA y los que tienen RNA. Los virus de RNA tienen su ciclo celular en el citoplasma mientras que los de DNA deben tener su replicación en el núcleo. De esta manera, los virus de DNA presentan mecanismos de regulación similares a los de la planta huésped, mientras que los virus de RNA tienen mecanismos de regulación diferentes. Los virus DNA constituyen aproximadamente el 2% de los virus vegetales que se conocen  y se dividen Caulimovirus (de doble cadena, Fig.12) y en Geminivirus (cadena sencilla, Fig.13).  La mayoría de las técnicas para vectores virales usan Virus de DNA ya que es más fácil trabajar con ellos.

Estas son las principales ventajas que ofrecen:

  1. a) Facilidad en la infección.
  2. b) Rango de hospedadores más amplio.
  3. c) Producción de altos niveles de proteína.
  4. d) Los genes transmitidos no se limitan a una célula.
  5. e) Mayor velocidad en la expresión.

Y entre sus desventajas podemos mencionar las siguientes:

  1. a) El tamaño del gen de interés debe ser pequeño.
  2. b) Pueden provocar síntomas específicos de enfermedad o ser letales.
  3. c) Alta frecuencia de errores durante la síntesis de ARN.
  4. d) El transgen no se integra en el genoma vegetal.
  5. e) El transgen no se transfiere necesariamente a la descendencia.

4) Vectores Transposones

Los Transposones (llamados también Genes Saltarines) son fragmentos de DNA que realizan saltos de una zona del DNA a otra. Este descubrimiento condujo a la posibilidad del uso de los Transposones  (Fig.14) como vectores de transferencia génica. El caso más famoso es del Maíz, ya que los Transposones son los que generan la variabilidad de colores en los granos cuando se presentan en un mismo maíz (Fig.15).

Esta técnica se utiliza para clonar varios genes de plantas usando Transposones. Se usa un gen mutado que porta un inserto transposón, este se aísla primero usando un transposón previamente clonado como sonda para encontrar el DNA flanqueante. Este DNA flanqueante se usa posteriormente como sonda para aislar el gen desde la línea salvaje (Wild Type). Mas sin embargo, dicha técnica usando Transposones como vectores no está del todo definida y su metodología no está estandarizada todavía. Además presenta un amplio rango de variabilidad en los resultados.

Para concluir, podemos mencionar que en general, las técnicas más usadas son la del Agrobacterium y la de Biobalística, y  debido a su alta eficiencia y estabilidad se usan tanto para Investigación experimental como para aplicaciones comerciales e industriales.  La eficiencia de estas técnicas está limitada a los métodos de cultivo de tejido que se empleen y a los modernos avances que en esta área se tenga sobre el genotipo a transformar.

 MAESTRO ALBINO ARRAMBIDE

Bibliografía: 

BIRCH, R. 1997. Plant transformation: Problems and Strategies for Practical Application. An. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48:297-326

DANILOVA, S. 2007. The technologies for genetic transformation of Cereals. Russian J. Plant Physiol. 54(5):569-581.

GRANADOS, C.S, CHAPARRO-GIRALDO, A. 2012. Plant Genetic transformation Methods. Rev. U.D.C.A Act. & Div. Cient. 15(1): 49-61

http://porquebiotecnologia.com.ar/index.php?action=cuaderno&opt=5&tipo=1&note=18

http://ciencia-en-red.fisimur.org/biologia/Transformacion%20de%20celulas%20vegetales%20obtencion%20de%20plantas%20transgenicas.pdf

 

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